Один и тот же спектр молока позволяет рассчитать жир, белок и лактозу. При этом детектор MilkoScan регистрирует световой сигнал, в котором вклады всех компонентов смешаны. Чтобы получить из него несколько отдельных чисел, прибору нужны два разных преобразования: сначала из сигнала восстанавливают спектр, затем по калибровке определяют состав. Первое опирается на физику интерференции, второе – на связь спектров с результатами химических анализов.
Именно на втором этапе становится существенным, какое молоко измеряют. Спектрометр способен зарегистрировать и новую рецептуру, и непривычный вид сырья. Но достоверность рассчитанного состава зависит от того, встречались ли подобные образцы при построении и проверке модели.
Как движение зеркала позволяет разделить длины волн
В средней инфракрасной области молекулы поглощают энергию, которая возбуждает колебания химических связей. У жира, белка и углеводов есть характерные полосы, но спектр молока складывается из их перекрывающихся вкладов и сильного поглощения воды. Пропустив излучение через пробу, можно определить, в каких участках оно ослабло и насколько.
В FTIR-анализаторе это делают с помощью интерферометра. В типовой схеме Майкельсона светоделитель направляет излучение по двум путям: к неподвижному и подвижному зеркалам. Отражённые пучки снова соединяются. В зависимости от разности пройденных расстояний световые волны усиливают или ослабляют друг друга.
При движении зеркала разность путей меняется. Для одной длины волны усиление и ослабление чередуются регулярно; короткая волна за тот же ход зеркала создаёт больше чередований, чем длинная. Детектор получает сумму таких изменений сразу для всего рабочего диапазона. Эту зависимость сигнала от разности оптических путей называют интерферограммой. Детектор измеряет изменение интенсивности при движении зеркала, а не колебания самого светового поля.
Преобразование Фурье выделяет из суммарной кривой составляющие с разными периодами. В учебном примере с двумя спектральными полосами из одной сложной интерферограммы получаются два максимума. Для широкого спектра расчёт восстанавливает интенсивность на множестве волновых чисел. Волновое число обратно длине волны: например, 1000 см-1 соответствует 10 мкм. Так устроено получение спектра в FTIR.
Полученный спектр интенсивности ещё содержит особенности источника, оптики и детектора. Их учитывают с помощью фонового измерения, предусмотренного методикой прибора. Отношение интенсивности с пробой I к фоновой I0 даёт пропускание T = I/I0. Для количественной обработки используют оптическую плотность A = -log10T. Если пропускание равно 10%, A = 1; при 1% она равна 2. Логарифм удобен потому, что в простом случае поглощение в такой записи пропорционально концентрации и толщине слоя.
Почему состояние пробы меняет спектр
Через сантиметровый слой молока в сильно поглощающих областях прошло бы слишком мало инфракрасного излучения. Поэтому молочные анализаторы используют очень короткий оптический путь. Например, в исследовании Afseth и соавторов на MilkoScan в составе CombiFoss 6500 толщина измерительного слоя составляла 37 мкм, или 0,037 мм. Перед ячейкой проба проходила через гомогенизатор и узел регулирования температуры.
Тонкий слой сохраняет измеримый сигнал в нужных участках спектра. Там, где вода поглощает почти всё излучение, небольшое изменение концентрации уже трудно отделить от шума: детектору практически нечего измерять. Такие области мало помогают количественному анализу, даже если в них есть полосы интересующего вещества.
Молоко также рассеивает свет на жировых шариках и казеиновых мицеллах. Поэтому две пробы одинакового химического состава могут дать разные спектры, если различается размер частиц. Гомогенизатор дробит жировые шарики и делает оптические свойства пробы более воспроизводимыми. Жира от этого не становится меньше, но меняется взаимодействие света с его частицами. Перемешивание выполняет другую задачу: возвращает всплывший жир в объём, чтобы отобранная порция представляла всю пробу.
Температура влияет на вязкость, состояние жировой фазы и форму полос поглощения, в том числе водных. Пузырёк частично заменяет молоко воздухом в измерительном слое, а налёт на окнах добавляет собственное поглощение и меняет прохождение света. Остаток сливок после предыдущей пробы способен изменить состав следующей порции. Поэтому подготовка образца, работа гомогенизатора и промывка входят в сам процесс измерения: их нарушения возникают ещё до расчёта концентраций.
Как калибровка учится различать компоненты
Для простого раствора иногда достаточно измерить высоту одной изолированной полосы. В молоке один участок спектра часто зависит сразу от нескольких компонентов и от рассеяния. Поэтому модель использует сочетание множества спектральных переменных. Перед расчётом могут корректировать фон, масштаб спектра или использовать его производные, чтобы лучше выделить форму перекрывающихся полос. Производная усиливает и мелкие случайные колебания, поэтому предобработку выбирают вместе с моделью и проверяют на новых данных.
Калибровку строят на парах «спектр – референсное значение». Одну пробу измеряют инфракрасным прибором, другую её порцию анализируют независимым методом. Для жирнокислотного состава в работе Afseth использовали газовую хроматографию. Для основных компонентов нужны соответствующие им референсные определения. Ошибка присвоенного значения становится ошибкой обучающего примера: постоянное завышение в референсе будет передаваться и калибровке.
Один из распространённых методов такой обработки – PLS, регрессия методом частичных наименьших квадратов. Соседние точки спектра часто меняются совместно и несут похожую информацию. PLS объединяет их в несколько скрытых переменных – взвешенных сочетаний спектральных значений, связанных с изменением целевого показателя. Затем по этим сочетаниям строится прогноз. Такая переменная не обязательно соответствует отдельному веществу: она может объединять несколько полос и сопутствующих изменений спектра.
Слишком простая модель не разделяет все значимые влияния. Слишком сложная начинает подстраиваться под случайные особенности обучающих образцов. Поэтому число скрытых переменных выбирают по качеству проверки, а не по тому, насколько точно удаётся воспроизвести уже известные результаты. Один спектр можно обработать моделями для нескольких показателей, но каждая из них требует собственной проверки.
Для обучения нужны разнообразные пробы. Допустим, в выбранном наборе жирность почти всегда увеличивалась вместе с белком. Модель может частично опереться на признаки белка при расчёте жира. В привычном сырье это даст хорошее совпадение, а в продукте с отдельно изменённым содержанием белка связь нарушится. Поэтому набор должен охватывать разные сочетания состава, сезоны и технологические условия, с которыми затем столкнётся лаборатория.
На рисунке диапазон каждого компонента выглядит достаточным. Однако оранжевая точка находится вдали от сочетаний, на которых обучалась модель. В реальном анализе сравнивают многомерные спектры, поэтому совпадение жирности с рабочим диапазоном само по себе ещё не подтверждает пригодность калибровки. Замена молочного жира растительным, гидролиз лактозы или добавление сахара меняют спектральные связи даже при знакомом общем содержании сухих веществ.
Что проверяют до выдачи результата
Проверка на тех же пробах, по которым подобраны коэффициенты, показывает прежде всего качество подгонки. При перекрёстной проверке часть образцов временно исключают, строят модель на остальных и прогнозируют исключённые. Затем процедуру повторяют. Но даже такая оценка может оказаться слишком благоприятной, если почти одинаковые пробы одной партии попали и в обучение, и в проверку. Для оценки работы в новых условиях полезен отдельный набор из других партий или периода, который не участвовал в выборе модели.
Ошибку оценивают в единицах самого показателя. Средняя разность между прогнозом и референсом показывает систематическое смещение. RMSE – корень из среднего квадрата этих разностей – характеризует общий масштаб расхождений, сильнее учитывая большие ошибки. Например, при учебных отклонениях +0,10 и -0,10 процентного пункта среднее смещение равно нулю, а RMSE составляет 0,10. Ошибки не исчезли, хотя в среднем компенсировались. RMSE не задаёт максимальную ошибку отдельной пробы.
Повторяемость отвечает на другой вопрос: насколько близки результаты нескольких измерений одной пробы. Они могут хорошо совпадать между собой и одновременно быть смещены относительно референса. Высокая корреляция тоже недостаточна: постоянная прибавка к каждому результату сохраняет согласованность изменений, но нарушает совпадение чисел. Поэтому для лаборатории существенны и разброс повторов, и смещение, и ошибка на независимых образцах.
В эксплуатации контролируют не только формулу, но и спектральный отклик. После изменения состояния оптики, ячейки или гомогенизатора прежняя проба может дать иной сигнал. Стандартизация согласует отклик прибора с принятой системой спектров. Корректировка наклона и свободного члена действует уже на рассчитанные значения: например, устраняет устойчивую прибавку или пропорциональное расхождение. Эти процедуры не заменяют расширение калибровки для нового продукта.
Не каждый показатель на экране получают только из ИК-спектра. Например, в приложениях точки замерзания MilkoScan FT3 используется датчик проводимости. Поэтому способ проверки выбирают для конкретного показателя, а не для прибора в целом.
Если привычный контрольный образец сохраняет результат, а новая рецептура расходится с референсом, следует проверить область применения модели. Если сдвинулись и контрольные образцы, и обычные пробы, проверяют измерительную систему и её стандартизацию. Такое разделение помогает выбрать действие по причине ошибки: восстановить условия измерения, скорректировать устойчивое смещение или дополнить калибровку новыми образцами.
MilkoScan FT3 CombiFoss 7 MilkoScan Mars